摘要：摘要：目的 探討沉默軸突導向蛋白4D（Sema4D）基因對卵巢癌SKOV3細胞增殖、侵襲、轉移的影響,并驗證Sema4D干擾RNA對人卵巢癌裸鼠移植瘤生長(cháng)的抑制作用.方法 針對Sema4D基因構建短發(fā)夾RNA（shRNA）重組載體pshRNA Sema4D-A、pshRNASema4D-B和pshRNASema4D-C質(zhì)粒,并行酶切鑒定和測序分析.采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法篩選RNA干擾效果最佳的重組載體,通過(guò)脂質(zhì)體介導轉染卵巢癌SKOV3細胞（重組載體組）,并以空載體組（轉染空載體pcDNA3.1質(zhì)粒）和未轉染組（未作任何處理）為對照.采用RT-PCR法和Westem blot法分別檢測轉染前后SKOV3細胞中Sema4D mRNA和蛋白表達,并榆測轉染前后SKO3細胞的增殖、侵襲和轉移能力.建立人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,將滿(mǎn)足成瘤標準的15只裸鼠隨機分為pshRNASema4D組（重組載體組）、空載體組和未轉染組,每組5只,分別向瘤塊內注射pshRNASema4D-B（50μg/次）、空載體（50μg/次）和磷酸鹽緩沖液（PBS,100μl/次）,每3 d注射1次,共3周,觀(guān)察移植瘤生長(cháng)情況.結果 酶切鑒定和測序分析證實(shí),靶向Sema4D的3個(gè)ShRNA重組載體pshRNASema4D-A、pshRNASema4D-B和pshRNASema4D-C質(zhì)粒構建成功.RT-PCR法篩選顯示,重組載體pshRNASema4D-B質(zhì)粒干擾效果最佳.重組載體組轉染24、48和72 h時(shí),SKOV3細胞中Sema4DmRNA的相對表達水平分別為0.401.4±0.051、0.120±0.035和0.014±0.015,重組載體組轉染72 h時(shí)的Sema4D mRNA相對表達水平明顯低于空載體組（0.521±0.019）和未轉染組（0.536±0.040,P〈0.05）.Western blot法檢測顯示,重組載體組轉染24、48和72 h時(shí),細胞中Sema4D蛋白的相對表達水平分別為0.196±0.023、0.074±0.015和0.040±0.014,重組載體組轉染72 h時(shí)的Sema4D蛋門(mén)相對表達水平明顯低于空載體組（0.275±0.009）和未轉染組（0.282±0.015,P〈0.05）.與空載體組和未轉染組比較,重組載體組細胞增殖、侵襲和遷移能力受到抑制（P〈0.05）.注射p

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