用基因芯片研究異丙酚麻醉大鼠丘腦基因表達譜

作者：姜秀良，馬加海，張惠，徐禮鮮，楊昌照，田明

【關(guān)鍵詞】 基因芯片

【Abstract】 AIM: To investigate the alteration of gene expression profile of thalamus in rats anesthetized with propofol using gene chip. METHODS: Twelve SD rats were allocated randomly to 2 groups (6 in each group). 9 g/L saline， 100 mg/kg propofol were administered intraperitoneally in control group and propofol group respectively. One hour later， thalamus was dissected and the total RNA was isolated. cDNA was amplified through reverse transcript reaction. Biotinlabeled cRNA was synthesized using cDNA as template. After purification and fragmentation， the cDNA was hybridized with rat neurobiology U34 gene chips. Chips were scanned and genes were analyzed using Microarray Suite Version 5.0 software. Differentially expressed genes were classified according to their biological functions. RESULTS: Among the total 1323 probes detected， 221 genes showed differential expression in propofol group. The expression level of 80 and 141 genes increased or decreased respectively and 53 genes among them had expression level alteration over 2 times. The differentially expressed genes were mainly classified into ion channels， signal transduction， transcription factors and cytokines， etc. CONCLUSION: Propofol can induce a significant alteration of gene expression profile of thalamus in rats. Gene chip is an effective means of studying the underlying mechaninsm of general anesthetics.

【Keywords】 propofol; gene chip; gene expression profile; thalamus; rat

【摘要】 目的:運用基因芯片研究異丙酚麻醉大鼠丘腦基因表達譜的變化. 方法: SD大鼠12只，隨機分為對照組和異丙酚組，每組6只. 對照組、異丙酚組大鼠分別腹腔注射生理鹽水或100 mg/kg異丙酚. 1 h后，取丘腦，抽提RNA，以RNA為模板逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板轉錄生物素標記的cRNA，cRNA經(jīng)提純、片斷化后與大鼠神經(jīng)生物學(xué)表達芯片U34雜交；雜交后的芯片用掃描儀檢測信號，收集圖像，用Microarray Suite Version 5.0軟件分析差異表達基因并對其作初步功能分析. 結果：1323條待測基因中，異丙酚麻醉后221條基因差異表達，上調表達80條，下調表達141條，其中差異表達超過(guò)兩倍的為53條. 差異性表達的基因功能可分為離子通道、信號轉導、轉錄因子、細胞因子等. 結論：異丙酚麻醉可誘導大鼠丘腦眾多基因的差異表達，基因芯片是研究全麻機制的有效方法.

【關(guān)鍵詞】 異丙酚；基因芯片；基因表達譜；丘腦；大鼠

0引言

全麻藥作用于中樞神經(jīng)系統(central nervous system， CNS)的確切機制目前仍不清楚［1］. 異丙酚主要是引起意識消失、體動(dòng)反射消失和學(xué)習、記憶功能喪失等全麻效應. 近年來(lái)，又證實(shí)其具有鎮痛、鎮吐、腦保護及抗驚厥等作用. 基因芯片技術(shù)具有高通量、并行性和快速準確的優(yōu)點(diǎn)，已應用于藥物作用靶位和機制的研究［2］. 丘腦是中繼外周傷害性信息的主要部位之一和全麻藥作用的重要腦區［3-5］. 我們運用基因芯片研究異丙酚麻醉大鼠丘腦基因表達譜的變化，探討異丙酚的CNS作用機制.

1材料和方法

1.1材料成年健康雌性SD大鼠(第四軍醫大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心提供)12只，體質(zhì)量195～223 g，實(shí)驗前將大鼠放置在安靜、避強光的環(huán)境中飼養48 h以上. 隨機分為對照組和異丙酚組，每組6只. 異丙酚組大鼠腹腔注射100 mg/kg異丙酚（Astra Zeneca），對照組注射同等體積的生理鹽水.

1.2方法

1.2.1取材腹腔注射1 h后，大鼠斷頸處死，取全腦組織，置于冰上，切取丘腦，切成0.3~0.5 cm小塊，置于盛有RNAlater（Qiagen）的凍存管中，-20℃保存.

1.2.2RNA抽提、探針制備和芯片雜交簡(jiǎn)要步驟如下：用TRIzol Reagent（Invitrogen）試劑盒抽提丘腦組織總RNA；以RNA為模板，合成單鏈及雙鏈cDNA；再以雙鏈cDNA為模板，體外轉錄合成生物素標記的cRNA；cRNA用RNeasy（Qiagen）試劑盒純化后，進(jìn)行片段化處理，而后與測試芯片Test3（Affymetrix）預雜交進(jìn)行質(zhì)控；符合要求后分別與兩張大鼠神經(jīng)生物學(xué)表達芯片U34（Affymetrix）雜交；洗脫處理后染色，以G2500A GeneArray Scanner（Affymetrix）掃描檢測信號，收集圖像.

統計學(xué)處理:應用Microarray Suite Version 5.0軟件（Affymetrix）分析某基因是否有表達，以及在異丙酚組和對照組表達程度是否有差異. 兩組基因的差異性表達用兩張芯片上對應探針之間的熒光信號強度比值的對數（Signal Log Ratio，SLR）表示，SLR表示異丙酚組較對照組某基因表達上調或下調倍數的以2為底的對數值. 根據基因編碼蛋白的功能對差異表達超過(guò)兩倍的基因進(jìn)行了初步分析.表1異丙酚麻醉大鼠丘腦表達上調兩倍以上基因（略）

2結果

2.1動(dòng)物行為學(xué)對照組大鼠活動(dòng)自如，異丙酚組大鼠注射異丙酚后，翻正反射消失，取材時(shí)仍未恢復.

2.2基因芯片異丙酚組和對照組分別有647條、692條基因表達，分別占芯片上探針總數（1323）的48.9%和52.3%. 與對照組相比，異丙酚麻醉后221條基因差異表達，其中上調表達80條，占總探針數的6.0%，超過(guò)兩倍的為27條；表達下調的基因為141條，占總探針數的10.6%，超過(guò)兩倍的為26條. 差異表達超過(guò)兩倍（SLR≥2）的基因（表1，2）.表2異丙酚麻醉大鼠丘腦表達下調兩倍以上基因（略）

2.3基因生物學(xué)信息分析除去5條功能未知基因，根據基因編碼蛋白的功能對其它差異表達超過(guò)兩倍的基因進(jìn)行了初步分析，可分為離子通道基因、信號轉導相關(guān)基因、轉錄相關(guān)基因、細胞因子基因、突觸功能基因、細胞結構基因等.

3討論

基因芯片是在固體基片表面上集成已知序列的基因探針(cDNA或寡核苷酸)，被測生物細胞或組織中大量標記的核酸序列與上述探針陣列進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測雜交探針的位置，實(shí)現基因信息的快速檢測［6］. Chong等［7］用該技術(shù)研究注射氟哌利多28 d后大鼠紋狀體的基因表達譜，發(fā)現待研究的1176條基因中，包括谷氨酸受體、鈉通道、RasGTP酶等的14條基因的表達有顯著(zhù)性差異，認為基因芯片對研究藥物中樞神經(jīng)系統的神經(jīng)轉導通路具有重要意義. Affymetrix基因芯片是目前公認的最先進(jìn)、最可靠的基因芯片平臺. 我們采用的大鼠神經(jīng)生物學(xué)表達芯片U34涵蓋多種與神經(jīng)生物學(xué)研究領(lǐng)域相關(guān)的基因序列，含有1323條探針組合（probe set）［8］. 丘腦作為感覺(jué)傳入通路中重要的中繼站，在感覺(jué)傳入、痛覺(jué)調控及意識維持上有相當重要的作用，腦功能成像研究表明，丘腦是麻醉藥發(fā)揮作用的主要靶位［3，5］.

目前認為全麻作用主要與配體門(mén)控型離子通道（如GABAA受體、NMDA受體），電壓門(mén)控型離子通道（Ca2＋，K＋，Na＋），第二信使系統，中樞神經(jīng)遞質(zhì)的攝取和釋放有關(guān)，涉及非常復雜的網(wǎng)絡(luò )調控機制［1，9-10］. 但目前有關(guān)全麻藥的中樞作用機制尚未從基因水平上揭示，而傳統的RTPCR，Southern Blot等基因表達研究方法難以同時(shí)獲得足夠信息，更無(wú)法了解基因間的相互關(guān)系. 本研究我們應用U34芯片對單次注射異丙酚大鼠丘腦基因表達譜進(jìn)行了全景式研究，結果發(fā)現，在1323條待測基因中，異丙酚麻醉后221條基因差異表達，其中上調表達80條，差異表達超過(guò)兩倍的為53條. 對差異性表達的基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析可發(fā)現，基因主要涉及離子通道、信號轉導、轉錄因子、細胞因子、凋亡等.

我們發(fā)現：①異丙酚可引起多個(gè)GABAA受體亞單位基因差異表達，甘氨酸受體、5羥色胺受體、腎上腺素受體等多個(gè)配體門(mén)控型離子通道基因亦有差異表達. 同時(shí)，電壓門(mén)控型離子通道如Ca2＋，K＋，Na＋亦有差異表達. 結果進(jìn)一步說(shuō)明配體和電壓門(mén)控型離子通道是異丙酚重要作用靶位，而且不同的通道亞單位對異丙酚敏感性不同. ②異丙酚能增加腦PKC活性，而PKC的活性與IP3/Ca2＋和DG/PKC調節相關(guān)；抑制NO/cGMP信號轉導系統［11-12］. 異丙酚麻醉后，G蛋白、PKC，NOS，IP3等多種信號轉導分子及其活性調節分子基因（U21954，AA851136，L09119，J0362）表達上調或下調，說(shuō)明異丙酚麻醉涉及多個(gè)信號傳導通路. ③異丙酚麻醉可引起大鼠丘腦眾多基因差異表達，說(shuō)明異丙酚的中樞作用機制涉及多種靶分子和多條神經(jīng)通路，結果驗證了文獻報道的異丙酚可能的作用位點(diǎn)并發(fā)現了一些新的作用位點(diǎn)，有助于從基因水平認識和理解異丙酚作用機制. 本研究結果表明，基因芯片可以同時(shí)檢測與全麻藥作用相關(guān)的眾多基因的差異表達，為深入研究全麻藥作用機制提供了方便快捷、高通量和并行性的研究工具.

本研究的局限性在于，暫時(shí)還不能明確這些基因之間的調控關(guān)系和主次關(guān)系，若能得到異丙酚不同作用時(shí)間基因表達譜，對數據進(jìn)行聚類(lèi)等分析，可深入了解異丙酚作用的靶分子和神經(jīng)通路.

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